SILAC—细胞定量质谱分析_分子靶标筛选_系统研究方案

SILAC—细胞定量质谱分析

必需氨基酸（如K、R、L、M等）是哺乳动物细胞无法自身合成的氨基酸，必须从食物中摄入。我们使用的哺乳动物细胞系培养的培养基（DMEM，RPMI-1640等）中都加入了“必需氨基酸”。
SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture) 定量蛋白质组学技术就是利用哺乳动物细胞对“必需氨基酸”依赖的原理，用稳定同位素（2H, 13C, 15N）标记的“必需氨基酸”[如13C6, 15N2-K，缩写为K8，13C6, 15N4-R，缩写为R10] 取代培养基（DMEM, RPMI-1640等)中的普通K（缩写为K0) 和R (缩写为R0)，K8比K0在质量上多8 Da (Dalton)，R10比R0多10 Da。方便起见，我们将该培养基记为K8R10，普通的培养基我们记为K0R0。
比如我们要比较细胞中某个基因敲除（KO）前后（可应用于各种实验条件，比如KD，过表达、药物处理等等），细胞蛋白质组的差异变化。我们就可以用SILAC技术进行。（1）对KO细胞，我们用K8R10培养基进行培养，则K8和R10通过蛋白质合成就“掺入”到细胞的每个蛋白质分子对应的K和R氨基酸残基上，实现了对细胞蛋白质组（Proteome）的标记，即在每个蛋白质分子上都引入K8和R10的稳定同位素标记；（2）对照细胞，用K0R0培养基培养，合成的蛋白质则是K0和R0标记的。（3）提取2组细胞蛋白，1:1等量混合后，用Trypsin对蛋白进行酶解，Trypsin特异性地从蛋白质的K和R处切割成肽段，生成的肽段几乎都是以K和R结尾的。这样来自两组的蛋白质酶解后生成的肽段是成对的，即XXXXXX-K8 vs. XXXXXX-K0 (8 Da质量差)， XXXXXXXXX-R10 vs. XXXXXXXXX-R0 (10 Da质量差 )，每对肽段在一级质谱（MS）上会观察到一对质谱峰（MS Pair），质谱峰的信号强度的相对比值就是该肽段对应蛋白质在2组样品中的表达水平差异。根据SILAC的蛋白质相对定量信息，最终通过统计分析，筛选显著差异表达的蛋白质。
SILAC进行差异蛋白质表达谱筛选是其基本的应用。SILAC技术的高阶应用在分子互作和后修饰（蛋白质-蛋白质互作、RNA-蛋白质互作、小分子-蛋白质互作、DNA-蛋白质互作、蛋白质翻译后修饰）等定量分析领域，定量准确，后续生物学验证阳性率高。

*谱璟科技SILAC-细胞定量质谱分析方案及产品*

谱璟科技基于其技术积累，可开展多种类型的SILAC-细胞定量蛋白质组学实验服务。
谱璟科技有多样化的SILAC产品线，现货供应，可迅速开展实验，缩短实验周期。
谱璟科技具备成熟的细胞生物学平台，可轻松完成对细胞SILAC标记、传代和各种实验条件处理。
谱璟科技具备稳定的质谱技术平台，无缝衔接上游制备的蛋白质样品，轻松开展蛋白质的质谱鉴定、定量、生信分析，快速筛选差异表达的蛋白。
依托我们的分子与细胞技术平台，在步骤4的基础上，对候选差异蛋白进行下游的WB、qPCR验证以及后续更为深入的功能与机理解析服务。

SILAC for Cell_

*SILAC-细胞差异表达蛋白质组分析项目DMEO数据*

一、实验设计与流程：

SILAC-实验设计

二、DEMO数据：

SILAC-差异组DEMO数据.PNG

A. 蛋白质鉴定与定量数目统计。共鉴定到>=2条肽段的蛋白质7093种，其中有定量信息的蛋白质为6818种，占比为96.12%。B. 定量蛋白质的log2 (Ratio H/L normalized) 分布图。C. 差异蛋白质筛选。共筛选（Benjamin-Hochberg FDR < 0.05）到上调蛋白19种（Up）和下调蛋白35种（Down）。

参考文献：

Hoedt E, Zhang G, Neubert TA: Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for quantitative proteomics. Advancements of mass spectrometry in biomedical research 2019:531-539.

我司助力的代表性SILAC研究案例：

Cao T, Zhang L, Zhang Y, Yan G, Fang C, Bao H, Lu H: Site-Specific Quantification of Protein Ubiquitination on MS2 Fragment Ion Level via Isobaric Peptide Labeling. Analytical Chemistry 2017, 89(21):11468-11475.
Di Y, Zhang Y, Zhang L, Tao T, Lu H: MdFDIA: A Mass Defect Based Four-Plex Data-Independent Acquisition Strategy for Proteome Quantification. Analytical Chemistry 2017, 89(19):10248-10255.